ІФА-діагностика: у чому суть визначення антитіл, як проводять і при яких хворобах ефективна? Сучасні методи діагностики ВІЛ-інфекції Анти ВІЛ 1 2 що.

Власники патенту RU 2283497:

Винахід відноситься до галузі біотехнології та медицини. Імуноферментна тест-система для ідентифікації спектру антитіл до вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) першого та другого типів, першого типу групи Про та виявлення антигену до вірусу імунодефіциту людини першого типу р24 включає імуносорбент на основі антигенів вірусу імунодефіциту людини являють собою gp41 та ВІЛ-2 групи О), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВІЛ-2), антитіл до антигену ВІЛ 1 p24, та детектуючі реагенти, при цьому вищеперелічені антигени ВІЛ та антитіла ВІЛ сорбовані в різних лунках планшетів для імуноферментного аналізу, і для сорбції використовують 96-лункові полістиролові розбірні або нерозбірні планшети. Винахід забезпечує підвищення чутливості, спрощення, виключення суб'єктивності оцінки результатів. 1 з.п. ф-ли, 10 табл., 1 іл.

Винахід відноситься до галузі біотехнології та медицини. Використання: диференційоване виявлення всіх класів специфічних антитіл до білків вірусу імунодефіциту людини 1 та 2, ВІЛ 1 групи Про та антигену р24 ВІЛ 1.

Сутність: отримання імуноферментної тест-системи для ідентифікації спектру антитіл 1 та 2, ВІЛ 1 групи Про, виявлення антигену р24 ВІЛ 1 та підтвердження позитивних або сумнівних результатів скринінгу на антитіла до ВІЛ 1 та 2, ВІЛ 1 групи Про та антиген р24 ВІЛ 1.

ОПИС ВИНАХОДУ

Лабораторна діагностика ВІЛ-інфекції базується на трьох напрямках: а) індикація ВІЛ та його компонентів; б) виявлення антитіл до ВІЛ; в) визначення змін у імунній системі. Серед існуючих методівлабораторної діагностики найбільш поширені серологічні – виявлення антитіл до антигенів вірусу.

Для виявлення антитіл при ВІЛ-інфекції в основному використовують імуноферментний аналіз (ІФА) та імуноблотинг (ІХ). В основі ІФА лежить іммобілізація вірусних антигенів на планшетах, з якими зв'язуються антитіла хворого, а комплекс антиген-антитіло виявляється за допомогою кон'югованих з пероксидазою хрону моноклональних антитіл миші до імуноглобулінів G та М людини. Метод досить специфічний і чутливий і дозволяє виявляти вірусспецифічні антитіла у 95% хворих. Інші 5% випадків припадають на ранні етапи інфікування, коли антитіл у сироватці крові ще мало або на термінальні фази хвороби, коли організм вже не в змозі синтезувати антитіла через різке виснаження імунної системи. Можливі також хибнопозитивні результатиІФА, переважно у хворих на аутоімунні та онкологічні захворювання, а також при інфекції, викликаній вірусом Ешптейна-Барр. При цьому відбувається перехресна реакція антитіл до ревматоїдного фактора, вірусу Епштейна-Барр або до антигенних детермінантів, схожих на білки головного комплексу гістосумісності 1 і 2 класу (HLA-4 і DQW3) і здатністю зв'язуватися з антигенами ВІЛ. Хибнопозитивні результати часто спостерігаються у вагітних жінок та людей похилого віку. Гемоліз, ліпемія, бактеріальне забруднення сироваток також можуть бути причиною недостовірних результатів.

У зв'язку з цим запропоновано та використовується ряд методів для перевірки специфічності результатів виявлення антитіл. З цих методів найчастіше застосовують реакцію "імунний блотинг" у модифікації "Western Blot". Суть методу полягає в наступному: на першому етапі роблять поділ білків ВІЛ за молекулярною вагою за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі. Потім здійснюється електрофоретичне перенесення з поліакриламідного гелю на поверхню нітроцелюлозної мембрани. Перенесені в такий спосіб антигени виявляються мембрані з допомогою непрямого аналізу: мембрана інкубується з досліджуваним матеріалом; антитіла, що містяться, зв'язуються з антигенами ВІЛ, перенесеними на нітроцелюлозну мембрану, далі смужки мембрани інкубуються з кон'югатом; при утворенні комплексу антиген-антитіло, кон'югат приєднується до нього, після відмивання від кон'югату та інкубації з субстратом відбувається забарвлення тих ділянок нітроцелюлози, де відбулося утворення комплексу антиген – антитіло – кон'югат. На кресленні представлені приклади позитивного, слабопозитивного та негативного результатів імуноблоту.

У сироватці осіб, інфікованих ВІЛ-1 та ВІЛ-2, виявляють антитіла до наступних білків (р) та глікопротеїдів (gp): таблиця А.

У таблиці В представлені критерії оцінки результатів імунного блотингу, рекомендовані ВООЗ та Російським центромз профілактики та боротьби зі СНІДом.

Виходячи з критеріїв ВООЗ, позитивними вважають сироватки, в яких методом ІХ виявляють антитіла до двох білків оболонки ВІЛ-1. За наявності реакції тільки з одним з білків оболонки (gp160, gp120, gp41) у поєднанні з реакцією з іншими білками або без неї результат вважають сумнівним. За даними Федерального науково-методичного центру МОЗ РФ з профілактики та боротьби зі СНІДом можливе трактування сироваток як позитивних і за наявності антитіл тільки одного білка оболонки.

Виявлення антитіл до антигену р24 може вказувати на період початку сероконверсії, оскільки антитіла саме цього білка з'являються першими. Позитивні реакції з білками gag і pol без реакції з білками env можуть відображати стадію ранньої сероконверсії, а також вказувати на наявність інфекції ВІЛ-2 або на неспецифічну реакцію.

Використання при діагностиці ВІЛ як експертний метод реакції імуноблотингу має ряд істотних недоліків:

1. Неможливість підтвердження виявлення антигену р24 ВІЛ 1 у разі використання тестів, що визначають одночасно антиген та антитіла до ВІЛ, що робить недоцільним (безглуздим) використання в якості скринінгових тестів для одночасного виявлення антигену та антитіл до ВІЛ (наказ МОЗ РФ №297 від 30). 2001: "для обстеження донорів на станціях переливання крові необхідно використовувати тест-системи, що виявляють одночасно антиген та антитіла до ВІЛ").

2. Виявлення антитіл лише IgG класу. Неможливе повноцінне підтвердження позитивних результатів, отриманих при використанні тестів 3 та 4 покоління (що виявляють антитіла IgG та IgM).

3. Суб'єктивність інтерпретації оцінки тесту, особливо у випадках "сумнівних" та "невизначених" результатів та початкових стадіяхсероконверсії (смуги, що виявляються на нітроцелюлозних мембранах в цих випадках бувають нечіткими, ледь видно неозброєним оком і при оцінці різними особами часто спостерігаються розбіжності).

4. Неможливість автоматизованої кількісної оцінки результатів аналізу.

5. Нижча порівняно з ІФА чутливість.

6. Недовговічність зберігання (при зберіганні смужки нітроцелюлозної мембрани вицвітають і не можуть бути об'єктивним підтвердженням виявлення або не виявлення ВІЛ у спірних випадках).

7. Труднощі при постановці реакції та зберіганні (смужки нітроцелюлозної мембрани дуже тендітні і часто ламаються).

8. Висока вартість наборів ІБ.

Відомий реагент, що є набір для одночасного визначення антигенів і антитіл до одного і того ж патогену, у тому числі ВІЛ (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Проте не розкривається тест-система, що дозволяє діагностувати ВІЛ-інфекцію на різних стадіях.

Завданням цього винаходу є отримання тест-системи, за допомогою якої досягається можливість підтвердження позитивних або сумнівних результатів скринінгових досліджень на антитіла до ВІЛ 1 та 2, ВІЛ 1 групи Про та антиген р24 ВІЛ 1 при використанні тестів для одночасного виявлення антигенів та антитіл.

Пропоноване технічне рішення досягається імуноферментною тест-системою для ідентифікації спектру антитіл до вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) першого і другого типів, першого типу групи Про виявлення антигену р24 до вірусу імунодефіциту людини першого типу р24, що характеризується тим, що вона включає імуносорбент на основі анти вірусу імунодефіциту людини, що являють собою gp41 (env ВІЛ-1 та ВІЛ-2 групи О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВІЛ-2), антитіл до антигену ВІЛ 1 р24, і детектуючі реагенти, при цьому перераховані вище антигени ВІЛ і антитіла ВІЛ сорбовані в різних лунках планшетів для імуноферментного аналізу.

Крім того, для сорбції використовують 96-лункові полістиролові розбірні або нерозбірні планшети для імуноферментного аналізу.

Технічний результат, що досягається цим винаходом полягає у можливості підтвердження позитивних результатів на антитіла до ВІЛ 1 і 2, ВІЛ 1 групи Про та антиген р24 ВІЛ 1, високої чутливості, можливості автоматизованої інтерпретації результатів, що виключає суб'єктивність оцінки, простоті виконання тесту, меншої порівняно з існуючими наборами ІБ вартості.

Це технічне рішення відрізняється від відомих:

1. Використання як твердофазного носія планшета для імунологічних реакцій.

2. Одночасним використанням як сорбент антитіл до р 24 ВІЛ та набору антигенів ВІЛ.

Винахід ілюструється наступним прикладом.

Початком розробленої тест-системи "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР + АГ р24 ВІЛ 1" є:

Імуносорбент - рекомбінантні антигени, аналогічні структурним білкам ВІЛ-1: gp41 (env ВІЛ-1 та ВІЛ 1 групи О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), ВІЛ-2: gp36 (env) та моноклональні антитіла миші до антигену ВІЛ 1(р24), розділені сорбовані на стрипах полістиролового розбірного планшета.

Для приготування імуносорбенту використовують:

1. HIV-1 gp41 – білок, що продукується штамом Е.Coli №AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 – білок, що продукується штамом Е.Coli №AHIV 109.

3. HIV-1 р24 – білок, що продукується штамом Е.Coli №AHIV 105.

4. HIV-1 p31 - білок, що продукується штамом Е.Coli №AHIV 108.

5. HIV-2 p36 – білок, що продукується штамом Е.Coli №AHIV 106.

Кон'югат 1, ліофілізований або рідкий - моноклональні антитіла миші до антигену р24 ВІЛ1, кон'юговані з біотином.

1. Кон'югат 2, ліофілізований або рідкий, - суміш рекомбінантних антигенів, аналогічних структурним білкам ВІЛ-1: gp41 (env ВІЛ-1 та ВІЛ 1 групи О), gp120 (env), р24 (gag), р31(ро1); ВІЛ-2: gp36 (env), кон'юговані з біотином;

2. Кон'югати 3, 4 – ліофілізовані або рідкі – стрептавідин, мічений пероксидазою хрону;

У ході попередніх досліджень було обрано дизайн тест-системи, відпрацьовано технологію приготування її компонентів, оптимізовано умови проведення імуноферментної реакції.

При постановці ІФА в тест-системі "ДС - ІФА - АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+Аг р24 ВІЛ 1" в лунки планшета з сорбованими антитілами до р24 вносять по 25 мкл кон'югату-1, а в лунки з сорбованими антигенами - по 25 мкл кон'югату-2. Схема постановки реакції наведена нижче. Далі кожну лунку вносять по 25 мкл досліджуваного зразка. При цьому в лунках з антигенами колір змінюється з оранжевого на рожевий, а в лунці з антитілами - із зеленого на сірий. Суміш інкубується 45 хв при 37 ° С на шейкері (або 1 годину при 37 ° С в термостаті). Потім без відмивання в лунки планшета визначення антигену р24 вносять по 50 мкл кон'югату-3, а лунки визначення антитіл по 50 мкл кон'югату-4. Після інкубації протягом 20 хв при 37 ° С на шейкері (або 30 хв при 37 ° С в термостаті) планшет промивають і виявляють субстратною сумішшю. Загальний час реакції 1 год 25 хв (або 1 год 50 хв). Присутній у досліджуваному зразку антиген р24 зв'язується з моноклональними антитілами до р24 а специфічні антитіла утворюють комплекс з рекомбінантними антигенами на планшеті. Імунний комплекс анти-р24 з р24, що утворився, виявляють кон'югатами анти-р24-біотин, потім стрептавідин-пероксидазою, а імунні комплекси Аг-ВІЛ з Ат-ВІЛ - кон'югатом Аг-біотин, потім стрептавідин-пероксидазою.

Схема постановки реакції.

Облік результатів проводять спектрофотометрично при двох довжинах хвиль: 450/620-680 нм з налаштуванням приладу "по повітрю". Допустимо облік результатів за однієї довжини хвилі 450 нм.

Результати аналізу враховують, якщо середні значення оптичної щільності (ОП) у лунках з К-не більше 0,2, у лунках з К+ - не нижче 1,0. ВП критий. розраховують за формулою:

ВП критий. gp41 = порівн. знач. ВП К-(gp41)+0,15

ВП критий. gp120 = порівн. знач. ВП К-(gp120)+0,15

ВП критий. р24 = порівн. знач. ВП К-(Р24) +0,15

ВП критий. р31 = порівн. знач. ВП К-(Р31) +0,15

ВП критий. gp36 = порівн. знач. ВП К-(gp36)+0,15

ВП критий. Ag р24 = порівн. знач. ВП до-(Ag p24)+0,04

де 0,15 та 0,04 - коефіцієнти, встановлені методом статистичної обробки на підприємстві-виробнику. У процесі розробки тест-системи було використано:

1. Зразки сироваток крові здорових донорів (n=610).

2. Зразки сироваток крові хворих з різними інфекційними захворюваннями, не пов'язаними з ВІЛ (ГРЗ, пневмонії, ангіни, герпетична та цитомегаловірусна інфекції, сифіліс, хламідіоз, вірусні гепатити А, В та С (n=224)).

3. Зразки сироваток крові хворих з різними неінфекційними захворюваннями – травми, захворювання серцево-судинної системи, онкологія (n=35).

4. Зразки сироваток крові вагітних жінок (n=40).

5. Зразки сироваток крові, серопозитивних в ІФА та підтверджених імуноблоті (n=428).

6. Зразки сироваток з позитивним результатом, отриманим в імуноферментних тест-системах для одночасного визначення антитіл ВІЛ 1,2 та антигену р24, і невизначеним результатом імуноблоту (n=123).

7. Внутрішня панель сироваток, що містять та не містять антитіла до ВІЛ 1,2, протестована на зареєстрованих МОЗ РФ імуноферментних тест-системах та імуноблоті (n=21).

8. Стандарт HIV 1 ANTIGEN STANDARD, BIO RAD, Франція, кат. №72217, що є антиген, отриманий з вірусного лізату.

9. Внутрішній стандарт підприємства. Зразок, що містить р 24 антиген концентрації 200 пг/мл, отриманий з вірусного лізату і відтитрований за стандартом "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" фірми "BIO RAD", Франція, кат. №72217.

10. Стандартна панель сироваток, що містять антитіла до вірусу імунодефіциту людини першого типу (ВІЛ 1) – ВЗГ 42-28-212-93-02П, "Медико-біологічний Союз", Новосибірськ.

11. Стандартна панель сироваток, що містять антитіла до вірусу імунодефіциту людини другого типу (ВІЛ 2) - ВЗГ-42-28-216-02П, "Медико-біологічний Союз", Новосибірськ.

12. Стандартна панель сироваток, що не містять антитіла до вірусу імунодефіциту людини першого типу та другого (ВІЛ 1, 2) - ВЗГ-42-28-214-94-02П, "Медико-біологічний Союз", Новосибірськ.

Оцінка чутливості тест-системи при детекції антигену р24 була проведена з використанням Стандарту HIV I ANTIGEN STANDARD, BIO RAD, Внутрішнього стандарту підприємства. При використанні Внутрішнього Стандарту були приготовлені 4 послідовні 2-кратні розведення від 40 пг/мл до 5 пг/мл з нормальною донорською плазмою, що не містить антитіл до ВІЛ 1, 2, як дилюент. Найменша кількість антигену, що виявляється, було прийнято за критерій чутливості. Отримані дані представлені у таблиці 1.

Для оцінки чутливості тест-системи при детекції специфічних антитіл були використані стандартні панелі зразків, що містять антитіла до вірусу імунодефіциту (ВІЛ 1, 2) людини (ОСО 42-28-212-93-02П с.012, ВЗГ 42-28-216- 02П (ВІЛ 2) с.003).

Отримані дані представлені у таблицях 3, 4.

Було проведено порівняння діагностичної ефективності тест-системи "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ 1" із тест-системами "Дженскрин-ВІЛ-Аг/Ат" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1 /2" (Діапроф-Мед), "Віроностика ВІЛ Уні-форм II Аг/Ат" (Biomerioux), "Рекомбінант-ВІЛ1,2 ДСМ" (МБС), "Амеркард Анти-ВІЛ-1,2 К" (Амеркард) , "ВІЛ-1, ВІЛ-2-ІФА-Авіценна" (Авіценна). Для цього зразки сироваток із внутрішньої панелі були протестовані у всіх вказаних тестах. Наведені в таблиці 5 результати вказують на високу діагностичну ефективність "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ 1".

Дослідження чутливості тест-системи "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ 1" проводилися також із сироватками крові пацієнтів, підтверджених в імуноблоті як ВІЛ позитивні. Загалом протестовано 428 зразків таких сироваток. Отримано кілька варіантів виявлення антитіл до різних білків ВІЛ та антигену р24. Результати представлені у таблиці 6.

Таблиця 6. Результати виявлення антитіл до різних білків ВІЛ 1 та антигену р24 при тестуванні ВІЛ 1 позитивних сироваток (n=428)
% виявлення	Білковий профіль
	анти-gр41	анти-gр120	анти-р24	анти-р31	р24
51,1%	+	+	+	+	-
35,3%	+	-	+	+	-
4%	+	-	+	-	-
3,3%	+	-	-	+	-
1,4%	+	-	-	+	+
1,2%	+	+	+	+	+
1,2%	+	+	-	+	+
0,9%	+	-	+	+	+
0,7%	+	-	+	-	+
0,5%	+	-	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	-
% виявлення антитіл до окремих білків або Аг р24	100%	53,9%	93,2%	94,4%	6,1%

При тестуванні ВІЛ 1 позитивних зразків 3% сироваток продемонстрували позитивну реакцію gp36 (env ВІЛ 2). ОП/ОПкрит. у цих зразках не перевищував 2,0. Отримані нами дані щодо крос реактивності білків зовнішньої оболонки ВІЛ 1 (gp41) та ВІЛ 2 (gp36) збігаються з літературними даними.

Інтерпретація результатів

Аналіз тестування ВІЛ позитивних сироваток та зразків із стандартних та внутрішньої панелей у "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ 1" дозволив розробити критерії для інтерпретації результатів цього тесту. Рекомендовані критерії наведено у таблиці 7.

Виходячи з цих критеріїв, всі зразки ВІЛ позитивних сироваток (n=428) визначені як позитивні і "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ1". З 16 зразків стандартної панелі, що містить антитіла до ВІЛ 1, 14 визначені як позитивні та 2 як невизначені. Усі 8 зразків із стандартної панелі, що містить антитіла до ВІЛ 2, визначені як позитивні. З 10 зразків внутрішньої панелі, що містить антитіла до ВІЛ 1, 7 визначені як позитивні та 3 як невизначені.

Дослідження чутливості тест-системи "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ 1" проводилися також із сироватками крові пацієнтів, які мають позитивний результат в імуноферментних тест-системах, що одночасно виявляють антитіла та антиген р24, та невизначений в імуноблоті . Загалом протестовано 123 такі зразки. Дані представлені у таблиці 8.

При тестуванні сироваток з невизначеним результатом імуноблоту (n=123) в "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ 1" 72 зразка (58,5%) продемонстрували позитивний результат. З них 26 сироваток (21,1%) позитивні тільки по р24, 20 (16,3%) – тільки за антитілами, 16 (13%) – по р24 з антитілами до одного з білків, 10 (8,1%) – по р24 з антитілами до двох і більше білків. Таким чином, тестування тільки антитіла (без виявлення р24) дозволило б визначити як позитивні 30 зразків (24,4%). Виявлення в тесті антигену р24 дозволило визначити як позитивні 42 додатково зразка (34,1%).

Для оцінки специфічності тест-системи була використана стандартна панель сироваток, які не містять антитіла до ВІЛ 1, 2 (n=20); зразки сироваток крові здорових донорів (n=610), зразки сироваток крові хворих із різними інфекційними захворюваннями (n=224), не пов'язаними з ВІЛ; зразки сироваток крові хворих з різними неінфекційними захворюваннями – травми, захворювання серцево-судинної системи, онкологія (n=35); зразки сироваток крові вагітних жінок (n=40). Усього протестовано 929 зразків. Один зразок із сироваток крові здорових донорів показав хибнопозитивний результат – виявлено антитіла до gp41 та р24. 7 зразків сироваток крові здорових донорів та 2 зразки сироваток крові хворих на інфекційні захворювання, не пов'язані з ВІЛ, показали хибнопозитивний результат по р24.

Для оцінки специфічності тест-системи було використано стандартну панель негативних зразків (ОСО 42-28-214-94-02п, с.009). Специфічність становила 100%.

Таким чином, проведені дослідження показали, що специфічність тест-системи "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ 1" становить 99% при дослідженні зразків сироваток крові нормальних донорів та хворих з різними інфекційними та соматичними захворюваннями.

Отримані дані показують високу діагностичну ефективність розробленої тест-системи "ДС-ІФА-АНТИ-ВІЛ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВІЛ 1". Тест-система може бути використана для виявлення антитіл до окремих білків ВІЛ 1 і 2 типів та антигену р24 ВІЛ1 з метою підтвердження позитивного результату скринінгу тест-системами, що виявляють антитіла, або тест-системами, що одночасно виявляють антитіла та антиген р24 ВІЛ1. Тест-система може бути використана як альтернативний імуноблоту тест для підтвердження позитивних результатів, а також для досліджень динаміки антитіл до ВІЛ та антигену р24 на різних стадіяхінфекції.

ПЕРЕВАГИ ТЕСТА

1. Підтверджує імуноферментний тест планшетного формату

2. Підтверджує тест, що поєднує визначення спектру антитіл ВІЛ 1, 2 та антигену р24 ВІЛ 1

3. Виявлення антитіл всіх класів Ig

4. Чутливість при детекції р24 щонайменше 5 пг/мл

5. Дозволяє скоротити кількість невизначених результатів порівняно з імуноблотом

6. Час аналізу – 1 год 25 хв (імуноблот – від 3 до 20 годин)

7. Візуальна оцінка внесення всіх компонентів та зразків.

1. Імуноферментна тест-система для ідентифікації спектру антитіл до вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) першого та другого типів, першого типу групи Про та виявлення антигену р24 до вірусу імунодефіциту людини першого типу р24, що характеризується тим, що вона включає імуносорбент на основі антигенів вірусу людини, що являють собою gp41 (env ВІЛ-1 та ВІЛ-2 групи О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВІЛ-2), антитіл до антигену ВІЛ 1 р24, та детектуючі реагенти, при цьому перераховані вище антигени ВІЛ і антитіла ВІЛ сорбовані в різних лунках планшетів для імуноферментного аналізу.

2. Імуноферментна тест-система за п.1, що відрізняється тим, що для сорбції використовують 96-лункові полістиролові розбірні або нерозбірні планшети для імуноферментного аналізу.

Найбільшого поширення сьогодні у світі набув СНІД - вірус із підродини ретровірусів, їх називають ще лентивірусами, або «повільними». Дійсно, в організмі людини вони починають проявляти активність після порівняно тривалого часу, приблизно років через 10.

Існує імунодефіцит першого та другого типу. Але сміливо можна говорити про експансію вірусу першого типу. Потрапивши в кров і приєднавшись до клітини, яка відповідає за імунітет, вірус починає швидко розмножуватися. Поки молекула CD4, що відповідає за його розпізнання, ідентифікує підступного ворога, він встигає заразити весь організм. Тому чим раніше його діагностувати, тим більше шансів у хворого отримати своєчасне лікування та довше прожити.

Якщо людина має привід перевірити себе на СНІД, зробити це слід негайно. Найчастіше основа такої діагностики – визначення в крові антитіл до імунодефіциту – білків, що виникають як реакція на присутність вірусу, а починають вони утворюватися в період від 1,5 до 6 місяців від часу можливого зараження. Відповідно і пройти діагностику доцільніше після закінчення цього періоду.

Визначається кількість антитіл, використовуючи аналіз, який отримав назву імуноферментного (ІФА). Цьому методу довіряють, він порівняно точний та високочутливий, ці показники становлять понад 99, 5%. Фармацевтичний ринок пропонує ряд наборів діагностичних тестів для ІФА: Комбібест ВІЛ, Анти-ВІЛ 1 2, КомбіБест анти-ВІЛ, КомбіБест анти-ВІЛ 1 2, КомбіБест анти-ВІЛ 1 2 d 0172. Ці тест-системи належать до третього покоління. Нестача зазначених реагентів: вони не завжди виявляють хворобу у ранні терміни. Людина вже вірусоносій, вона потенційно небезпечна для партнерів, але антитіла в крові ще немає.

Набори в основному оснащені кількістю тестів для проведення 12*8 або 192 анти-ВІЛ аналізів. Самостійно користуватися ними не рекомендується. В описі препаратів вказується, що їхнє головне призначення - виявити кількість антитіл до СНІДу обох типів. А також визначити антитіла всіх класів до СНІДу. Якщо антитіл немає, то хвороба не діагностована.

Четверте покоління тестів «бачить», крім антитіл, та антигени СНІДу, вони здатні виявити інфікування раніше, ніж засоби третього покоління. Для порівняння: антиген ВІЛ є в крові, починаючи вже з 5-ї доби, а перші антитіла з'являються не раніше, ніж через місяць. КомбіБест ВІЛ 1, 2 АГ/АТ (комплект 1) та КомбіБест ВІЛ 1, 2 АГ/АТ (комплект 2) належать до тестів 4-го покоління. Скориставшись набором цих реагентів, антитіла виявляють до типу 1, 2 і антиген р24, досліджуючи сироватку або плазму людської крові. Багато країн застосовують ІФА тестування саме 4 покоління, яке має ще й назву Антиген/Антитело, скорочено - АГАТ.

Проводиться тестування анонімно.

ВІЛ-інфекцію відносять до категорії неконтрольованих захворювань у зв'язку з відсутністю методів її специфічної профілактики та недостатньою ефективністю терапії. Тому контролю епідеміологічної ситуації з ВІЛ-інфекції нині переважно використовують скринінгові діагностичні дослідження. Чільне місце серед методів діагностики ВІЛ-інфекції займає імуноферментний аналіз (ІФА), що дозволяє виявляти у обстежуваних осіб серологічні маркери збудника захворювання.

У цьому повідомленні представлені результати визначення антитіл до ВІЛ у сироватці крові 40 823 осіб, до яких входили пацієнти жіночих консультацій, поліклінік, лікарень міста, а також медичних центрів, що спеціалізуються на обстеженні та лікуванні хворих груп ризику (наркомани, пацієнти з вірусними гепатитамиВ, С та венеричними захворюваннями). Дослідження було проведено у 2005 році в лабораторії імунології НДІ акушерства та гінекології ім. Д.О. Отта РАМН, що має більш ніж 15-річний досвід застосування методів ІФА для діагностики різних інфекційних захворювань.

Для первинного обстеження зразків сироватки крові використовували тест-систему "КомбіБест анти-ВІЛ-1+2" (ЗАТ "Вектор-Бест", Новосибірськ), що виявляє в обстежуваних зразках сироватки або плазми крові людини сумарні специфічні антитіла до ВІЛ-1 та ВІЛ- 2 (імуноглобуліни класів A, G та M). У даному діагностичному наборі рекомбінантні білки ВІЛ застосовують як для іммобілізації в лунки планшетів, так і у вигляді кон'югату з пероксидазою хрону. Оцінку результатів аналізу сироваток проводили відповідно до рекомендацій інструкції до тест-системи: негативними (що не містять антитіл до ВІЛ-1 та ВІЛ-2) вважали тестовані проби, оптична щільність (ОП) яких в ІФА не перевищувала значення ОПкрит.

При проведенні скринінгу в лабораторії для 40222 (98,5%) із 40823 зразків сироватки було отримано негативний результат ІФА, а 601 (1,5%) досліджена проба була розцінена як первинно позитивна. У результаті проведеного наступного дня повторного аналізу кожної з 601 сироватки в дублях (двох лунках планшета) 440 (73,2%) зразків було визначено як позитивні, а 161 (26,8%) – як негативні. Відповідно до рекомендацій Міністерства охорони здоров'я та соціального розвитку 440 позитивних у скринінгу сироваток було заморожено та передано для додаткових підтверджуючих досліджень до консультаційно-діагностичного кабінету референс-лабораторії лікарні № 30 ім. С.П. Бот-кіна. Ці дослідження були проведені з використанням імуноферментних тест-систем “ЕКОлаб-Віроностика ВІЛ 1,2 Аг/Ат” (“ЕКОлаб”, Електрогорськ), “Genscreen Plus HIV Ag-Ab” (“БіоРад”, США), а також наборів для імуноблоту. Результати аналізу 440 сироваток у підтверджуючих тестах дозволили зробити висновок, що 323 (73,4%) зразка є позитивними, а 102 (23,2%) негативними. Для 15 досліджених проб (3,4%) було отримано невизначений результат аналізу.

Слід зазначити, що значення ВП, отримані в нашій лабораторії при їх первинному тестуванні з використанням тест-системи КомбіБест анти-ВІЛ-1+2, для 314 (97,2%) з цих 323 позитивних сироваток становили від 0,900 до 1,780, а 9 (2,8%) зразків – 0,500–0,900. Величини ОП, отримані при скринінгу 102 негативних сироваток, для 52 зразків (51%) перебували в інтервалі від 0,195 до 0,400; для 40 (39,2%) проб - 0401-0800; 10 (9,8%) зразків – понад 0,800.

Таким чином, в результаті проведеної роботи показано, що первинне обстеження сироваток крові на наявність серологічних маркерів ВІЛ-інфекції з використанням тест-системи "КомбіБест анти-ВІЛ-1+2" є високоефективним. Позитивні результати скринінгу підтвердилися при проведенні додаткових досліджень у референс-лабораторії у 73% випадків, а хибнопозитивні – зареєстровані лише для 0,25% із 40 823 проаналізованих сироваток.

Опис

Підготовка

Показання

Інтерпретація результатів

Опис

Метод визначення Імуноферментний аналіз (ІФА).

Досліджуваний матеріалСироватка крові

Доступний виїзд додому

Комбіноване виявлення антитіл до ВІЛ типів 1 та 2 та антигену р24 ВІЛ, якісний тест.

Увага. При позитивних та сумнівних реакціях термін видачі результату може бути збільшений до 10-ти робочих днів. ВІЛ (вірус імунодефіциту людини), що викликає СНІД (синдром набутого імунодефіциту) – належить до сімейства ретровірусів. Передається від людини до людини при використанні забруднених голок та шприців для внутрішньовенного введення наркотиків або терапевтичних процедур, при сексуальних контактах як гетеро, так і гомосексуальних. Передача вірусу може статися при переливанні інфікованої крові та її продуктів, донорстві органів чи насіннєвої рідини, у медичних працівників – при пораненні інфікованими голками чи інструментами. Зараження ВІЛ можливе шляхом передачі від інфікованої матері дитині (вертикальний шлях), хоча сучасні методи профілактики із застосуванням антиретровірусної терапії, при виконанні всіх рекомендацій, дозволяють знизити такий ризик до мінімуму.

Процес взаємодії вірусу з клітиною включає ряд стадій: зв'язування вірусу з клітиною, звільнення його від оболонки, проникнення в цитоплазму, синтез ДНК з вірусної РНК, вбудовування вірусної ДНК у геном клітини-господаря. Після цього починається латентна стадія інфекції. У такому стані провірусна ДНК може існувати деякий час, не виявляючи активності та не впливаючи на життєдіяльність клітини-господаря. Поки що немає експресії вірусних білків, немає і імунної відповіді на вірус. Антитіла до ВІЛ, що характеризують імунну відповідь організму, з'являються після активації вірусної ДНК та початку активного розмноження вірусу. Тривалість латентного періоду залежить від низки факторів, включаючи індивідуальні генетичні особливості організму.

Антитіла до ВІЛ можуть виникнути, починаючи з другого тижня після інфікування; їх вміст збільшується протягом 2-4 тижнів і зберігається протягом багатьох років. У 90-95% інфікованих вони з'являються в перші три місяці після зараження, у 5-9% - у період від трьох до шести місяців, у 0,5-1% - у більш пізні терміни.

У перші тижні інфекції, ще до появи антитіл до вірусу (тобто до сероконверсії), у зразках сироватки чи плазми можна виявити присутність антигенів ВІЛ, зокрема його капсидного білка р24. Пізніше, після сероконверсії, він стає недетектируемым.

Комбіновані тест-системи 4-го покоління, до яких належить тест HIV Ag/Ab Combo (Architect, Abbott), виявляють як антитіла до ВІЛ 1 та 2 типів, так і антиген Р24 ВІЛ, що дозволяє проводити раннє виявлення інфекції. До особливих характеристик скринінгового тесту, що застосовується в лабораторії ІНВІТРО, для виявлення ВІЛ-інфекції варто віднести високу специфічність дослідження (> 99,5%); 100% чутливість аналізу до антитіл, характерних для періоду сероконверсії, та чутливість тесту до антигену р24 близько 18 пг/мл.

Порядок проведення лабораторного обстеження на ВІЛ суворо регламентований наказами МОЗ РФ і включає в себе етап скринінгового (відбіркового) дослідження наявності антитіл до ВІЛ імуноферментними (ІФА) методами, дозволеними до використання, і етап верифікаційного (підтверджує) більш розгорнутого дослідження. Слід зазначити, що навіть кращі скринінгові ІФА-системи не гарантують 100% специфічності, тобто існує певна ймовірність отримання неспецифічних, хибнопозитивних результатів, пов'язаних з особливостями сироватки крові пацієнта. Тому позитивний результат скринінгового ІФА обстеження може не підтвердитись у підтверджуючих тестах, після чого пацієнту видадуть негативний чи невизначений результат. При невизначеному результаті підтверджуючого дослідження, тестування слід повторити в динаміці через 2-3 тижні.

Лабораторна діагностика ВІЛ-інфекції у дітей, народжених від ВІЛ-інфікованих матерів, має свої особливості. У крові до 18-ти місяців із народження можуть циркулювати материнські антитіла до ВІЛ (класу IgG). Відсутність антитіл до ВІЛ у новонароджених не означає, що вірус не проник через плацентарний бар'єр. Діти ВІЛ-інфікованих матерів підлягають лабораторно-діагностичному обстеженню протягом 36 місяців після народження.

Підготовка

Спеціальної підготовки не потрібно. Рекомендується взяття крові не раніше ніж через 4 години після останнього прийому їжі. Із загальними рекомендаціями для підготовки до досліджень можна ознайомитись. Доцільно проводити дослідження на виявлення антигену та антитіл до ВІЛ не раніше, ніж через два тижні після можливого інфікування, з повторенням його через три та шість тижнів у разі негативного результату. Оформлення заявок для проведення досліджень у ТОВ «ІНВІТРО» здійснюється за паспортом або документом, що його замінює (міграційна картка, тимчасова реєстрація за місцем проживання, посвідчення військовослужбовця, довідка з паспортного столу при втраті паспорта, реєстраційна картка обліку з готелю). Пред'явлений документ обов'язково повинен містити інформацію про тимчасової чи постійної реєстрації біля РФ і фотографію. За відсутності паспорта (документа, що його замінює) пацієнт має право оформити анонімну заявку для здачі біоматеріалу. При анонімному обстеженні, заявці та отриманому від клієнта зразку біоматеріалу присвоюється номер, відомий лише пацієнту, та медперсоналу, який оформляє замовлення. ! Результати досліджень, виконаних анонімно, не можуть бути представлені для госпіталізації, професійних оглядів та не підлягають реєстрації в ОРУІБ.

Показання до призначення

• Збільшення лімфатичних вузлівпонад дві області.
• Лейкопенія з лімфопенією.
• Нічна пітливість.
• Різке схуднення незрозумілої причини.
• Діарея більше трьох тижнів неясна причина.
• Гарячка неясної причини.
• Планування вагітності
• Передопераційна підготовка, шпиталізація.
• Виявлення наступних інфекцій або їх поєднань: туберкульоз, маніфестний токсоплазмоз, герпесвірусна інфекція, що часто рецидивує, кандидоз внутрішніх органів, повторні невралгії герпес-zoster, викликана мікоплазмами, пневмоцистою або легіонелами пневмонія.
• Саркома Капоші у молодому віці.
• Випадкові статеві контакти.

Інтерпретація результатів

Інтерпретація результатів досліджень містить інформацію для лікаря і не є діагнозом. Інформацію з цього розділу не можна використовувати для самодіагностики та самолікування. Точний діагноз ставить лікар, використовуючи як результати даного обстеження, і потрібну інформацію з інших джерел: анамнезу, результатів інших обстежень тощо.

Одиниці вимірювання у Незалежній лабораторії ІНВІТРО: тест якісний. Форма представлення результатів: за відсутності антитіл до ВІЛ 1 та 2 та антигену р24 видається відповідь «негативно». У разі виявлення антитіл до ВІЛ або антигену у скринінговому імуноферментному тесті пробу сироватки відправляють для дослідження підтверджуючим методом імуноблоту до міського центру СНІД, який верифікує позитивні та невизначені результати.

Позитивний результат:

1. Віч інфекція;
2. хибнопозитивний результат, що вимагає повторних або додаткових досліджень *);
3. дослідження неінформативно у дітей до 18 місяців, народжених від ВІЛ-інфікованих матерів.

*Специфічність скринінгової тест-системи Антитіла до ВІЛ 1 та 2 та антиген ВІЛ 1 та 2 (HIV Ag/Ab Combo, Abbott), за оцінками, представленими виробником реагентів, становить близько 99,6% як у загальній популяції, так і у групі пацієнтів з потенційними інтерференціями (інфекції HBV, HCV, Rubella, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach. та ін., аутоімунні патології (включаючи ревматоїдний артрит, присутність антинуклеарних антитіл), вагітність, підвищений рівень IgG, IgM, моноклональні гаммапатії, гемодіаліз, множинні гемотрансфузії).

Своєчасна діагностика ВІЛ-інфекції стає вкрай важливим заходом, тому що раніше початок лікування може багато в чому зумовити подальший розвиток захворювання та продовжити життя хворого. В останні роки спостерігається вагомий прогрес у галузі виявлення цієї страшної хвороби: на зміну старим тест-системам приходять досконаліші, методи обстеження стають доступнішими, і їхня точність значно підвищується.

У цій статті розповімо про сучасні методи діагностики ВІЛ-інфекції, знати які корисно для своєчасного лікування цієї проблеми та підтримання нормальної якості життя хворого.

Методики діагностики ВІЛ

У Росії для діагностики ВІЛ-інфекції проводиться стандартна процедура, що включає два рівні:

• ІФА тест-система (скринінговий аналіз);
• імунний блот (ІБ).

Також для діагностики можуть застосовуватись інші методики:

• експрес-тести.

ІФА тест-системи

На першому етапі діагностики для виявлення ВІЛ-інфекції застосовується скринінговий тест (ІФА), який заснований на створених у лабораторіях білках ВІЛ, що вловлюють специфічні антитіла, що виробляються в організмі у відповідь на інфікування. Після їхньої взаємодії з реагентами (ферментами) тест-системи змінюється забарвлення індикатора. Далі ці зміни кольору обробляються на спеціальній апаратурі, яка визначає результат виконаного аналізу.

Такі ІФА-тести здатні показувати результат уже за кілька тижнів після впровадження ВІЛ-інфекції. Цей аналіз визначає не наявність вірусу, а виявляє вироблення антитіл щодо нього. Іноді, в організмі людини вироблення антитіл до ВІЛ починається через 2 тижні на поле зараження, але у більшості людей вони виробляються на пізніших термінах, через 3-6 тижнів.

Існує чотири покоління ІФА-тестів із різною чутливістю. В останні роки частіше застосовуються тест-системи III і IV покоління, які створені на основі синтетичних пептидів або рекомбінантних білків і мають більшу специфічність і точність. Вони можуть використовуватися для діагностики ВІЛ-інфекції, моніторингу поширеності ВІЛ та забезпечення безпеки під час перевірки донорської крові. Точність ІФА-тест-систем III та IV покоління становить 93-99% (більш чутливі тести, що випускаються у країнах західної Європи – 99%).

Для виконання ІФА тесту проводиться забір 5 мл крові з вени пацієнта. Між останнім прийомом їжі та аналізом має пройти не менше 8 годин (як правило, він виконується вранці натще). Такий тест рекомендується здавати не раніше ніж через 3 тижні після передбачуваного зараження (наприклад, після незахищеного статевого акту з новим статевим партнером).

Результати ІФА-тесту отримують через 2-10 днів:

• негативний результат: вказує на відсутність інфікування ВІЛ та не вимагає звернення до фахівця;
• хибнонегативний результат: може спостерігатися на ранніх термінахінфікування (до 3 тижнів), при пізніх стадіях СНІДу при вираженому придушенні імунітету та при неправильно проведеній підготовці крові;
• хибнопозитивний результат: може спостерігатися при деяких захворюваннях та при неправильно проведеній підготовці крові;
• позитивний результат: вказує на зараження ВІЛ-інфекцією, вимагає проведення ІБ та звернення пацієнта до спеціаліста до центру СНІДу.

Чому ІФА-тест може давати хибнопозитивні результати?

Неправдиві результати ІФА-тесту на ВІЛ можуть спостерігатися при неправильній обробці крові або у хворих з такими станами та захворюваннями:

• множинна мієлома;
• інфекційні захворювання, спровоковані вірусом Епштейна Барр;
• стан після;
• аутоімунні захворювання;
• на фоні вагітності;
• стан після вакцинації.

При вищеописаних причинах у крові можуть бути неспецифічні перехресно реагуючі антитіла, вироблення яких було спровоковано не ВІЛ-інфекцією.

В останні роки частота хибнопозитивних результатів суттєво знизилася завдяки застосуванню тест-систем III та IV покоління, які містять більш чутливі пептидні та рекомбінантні білки (вони синтезуються за допомогою генної інженерії in vitro). Після початку застосування таких ІФА-тестів частота неправдивих результатів значно знизилася і становить близько 0,02-0,5%.

Виявлення хибнопозитивного результату не означає, що людина інфікована ВІЛ. У таких випадках ВООЗ рекомендує провести ще один ІФА-тест (обов'язково IV покоління).

Кров пацієнта відправляється до референсу або арбітражної лабораторії з позначкою «повторити» і досліджується на ІФА тест-системі IV покоління. Якщо результат нового аналізу негативний, то перший результат визнається помилковим (хибнопозитивним) та ІБ не проводиться. При позитивному чи сумнівному результаті під час другого тесту хворому обов'язково призначається проведення ІХ через 4-6 тижнів для підтвердження чи спростування ВІЛ-інфікування.

Імунний блот

Остаточний діагноз інфікування ВІЛ може встановлюватися лише після отримання позитивного результату імунного блотингу (ІХ). Для його проведення застосовується нітроцелюлозна смужка, яку нанесені вірусні білки.

Забір крові для ІБ виконується з вени. Далі вона піддається спеціальної обробці і білки, що містяться в її сироватці, поділяють у спеціальному гелі за їх зарядом і молекулярною масою (маніпуляція проводиться на спеціальній апаратурі під впливом електричного поля). На гель із сироватки крові накладають нітроцелюлозну смужку і проводять блот («промокування») у спеціальній камері. Смужка обробляється і якщо в матеріалах є антитіла до ВІЛ, то вони зв'язуються з антигенними смугами на ІБ і виявляються у вигляді ліній.

ІБ вважається позитивним якщо:

• за критеріями American CDC – на смужці є дві або три лінії gp41, p24, gp120/gp160;
• за критеріями American FDA – на смужці є дві лінії р24, р31 та лінія gр41 або gр120/gр160.

У 99,9% випадків позитивний результат ІХ вказує на ВІЛ-інфікування.

За відсутності ліній – ІБ негативним.

При виявленні ліній з gр160, gр120 і gр41 ІБ є сумнівним. Такий результат може виявлятися при:

• онкологічні захворювання;
• вагітності;
• частих трансфузіях крові.

У разі рекомендується виконання повторного дослідження з допомогою набору інший фірми. Якщо ж після додаткового ІБ результат залишається сумнівним, необхідно спостереження протягом півроку (через кожні 3 місяці проводяться ІБ).

Полімеразна ланцюгова реакція

Тест на ПЛР може визначати РНК вірусу. Його чутливість досить висока і дозволяє виявляти ВІЛ-інфікування вже через 10 днів після зараження. У деяких випадках ПЛР може давати хибнопозитивні результати, тому що його висока чутливість може реагувати і на антитіла до інших інфекцій.

Дана методика діагностики є дорогою, потребує спеціального обладнання та високої кваліфікації спеціалістів. Ці причини не дозволяють проводити її при масовому тестуванні населення.

ПЛР застосовується у таких випадках:

• для виявлення ВІЛ у новонароджених, які народилися від ВІЛ-інфікованих матерів;
• для виявлення ВІЛ у «періоді вікна» або за сумнівного ІБ;
• контролю концентрації ВІЛ у крові;
• для дослідження донорської крові

Тільки за тестом ПЛР діагноз ВІЛ не ставиться, а проводиться як додатковий метод діагностики для вирішення спірних ситуацій.

Експрес-методи

Однією з інновацій у діагностиці ВІЛ стали експрес-тести, результати яких можуть оцінюватися вже за 10-15 хвилин. Найбільш ефективні та точні результати виходять за допомогою імунохроматографічних тестів, заснованих на принципі капілярного потоку. Вони є спеціальні смужки, на які наноситься кров або інші досліджувані рідини (слина, сеча). За наявності антитіл до ВІЛ через 10-15 хвилин на тесті з'являються кольорова та контрольна смужка – позитивний результат. При негативному результаті з'являється лише контрольна смужка.

Як і після тестів ІФА, результати експрес-тестів повинні підтверджуватись аналізом ІБ. Тільки після цього може встановлюватися діагноз про ВІЛ-інфікування.

Існують експрес-набори для домашнього тестування. Тест OraSure Technologies1 (США) схвалений FDA, продається без рецепта та може застосовуватись для виявлення ВІЛ. Після проведення тесту, у разі позитивного результату, хворому рекомендується пройти обстеження у спеціалізованому центрі для підтвердження діагнозу.

Інші тести для домашнього використання ще не були схвалені FDA і їхній результат може бути дуже сумнівним.

Незважаючи на те, що експрес-тести за своєю точністю поступаються ІФА-тестам IV покоління, вони широко застосовуються для додаткового тестування населення.

Здати аналізи на виявлення ВІЛ-інфекції можна в будь-якій поліклініці, ЦРЛ або спеціалізованих СНІД-центрах. На території Росії вони проводяться абсолютно конфіденційно або анонімно. Кожен пацієнт може розраховувати отримання медичної чи психологічної консультації до чи після проведення аналізу. Платити за тести на ВІЛ доведеться лише у комерційних лікувальних закладах, а у державних поліклініках та лікарнях вони виконуються безкоштовно.

Про те, якими шляхами можна заразитися ВІЛ-інфекцією та які міфи існують про можливості заразитися, читайте у